Tichý a skromný muž. Tak popisují kolegové letošního laureáta Nobelovy ceny za medicínu a fyziologii Yoshinoriho Ohsumi, buněčného biologa z Tokijského technologického institutu. Sám sebe pak Ohsumi popisuje jako vědce v oboru základního výzkumu kvasinek.
Profesor Ohsumi Yoshinori letos získal Nobelovu cenu za přínos v pochopení mechanismu autofagie neboli „sebe-snědení“. Tedy mechanismu, pomocí kterého buňky rozkládají samy sebe a který je důležitý pro život stejně jako pro jeho konec.
V době, kdy jsem začal se svou prací, vyšlo o autofagii každý rok asi dvacet, někdy i méně článků. Nyní jich vychází každý rok více než 5000. Za patnáct let to je obrovská změna.
Droždí pod mikroskopem
Píše se rok 1988, když tým okolo profesora Ohsumiho pozoruje pod mikroskopem kmeny kvasinek Saccharomyces cerevisiae, kterým chybí některé typy proteináz, tedy enzymů podílejících se na rozkladu bílkovin. Kromě pozorování ve standartních podmínkách neboli v mediu, které obsahuje vše, co si taková kvasinka k optimálnímu životu může přát, zkouší vědci pěstovat kvasinky i v prostředích, ve kterém některá složka výživy chybí. Obsahuje třeba menší množství proteinů, chybí v něm aminokyseliny nebo se nedostává glycerolu.
Zatímco v běžných podmínkách vědci nevidí nic jiného než spokojeně rostoucí kvasinky, v prostředí, ve kterém Saccharomycety strádají, se začíná dít něco zajímavějšího. Už po jedné hodině se ve vakuolách, organelách sloužících k rozkladu odpadních látek, začínají hromadit podivné kulovité kmitající útvary ohraničené membránou, která je však tenčí než ostatní membrány uvnitř buněk. Po třech hodinách již útvary vyplňují celý prostor vakuoly a jsou na sebe tak namačkány, že pohyb není možný.
Ohsumi se se svým týmem vydal ještě dál: díky křížení různých kmenů kvasinek se jeho týmu postupně podařilo vypátrat, který konkrétní gen (a tudíž i která konkrétní proteináza) je za hromadění útvarů zodpovědná. Biochemickou analýzou a zkoumáním buněk pod elektronovým mikroskopem pak zjistili, že v útvarech se nachází kousky cytosolu, hmoty vyplňující prostor uvnitř buněk, i s buněčnými organelami. Jinými slovy buňka do těchto váčků zachytává svůj vlastní obsah, který pak rozkládá, aby získala látky, které ji ve výživě schází. K tomuto závěrečnému rozkladu bezpodmínečně potřebuje jednu ze svých proteináz, a to proteinázu B. Bez ní se nenatrávené útvary hromadí ve vakuole, kde je Ohsumiho tým pozoroval.
Tento výzkum ještě nevysvětlil, jak přesně útvary vznikají, jak buňky určují, co se v nich zachytí, ani jak se dostanou do vakuoly. Ale byl to první významný krok potřebný ke složení celé skládačky. V roce 1992 své výsledky publikují v článku s názvem „Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction“, v překladu Autofagie u kvasinek prokázaná u mutantů deficientních v proteinázách a během podmínek, které ji indukují. V následujících letech pak své prvotní objevy Ohsumiho tým dále rozvíjel a postupně odhalil tajuplný nový buněčný mechanismus, pomocí kterého kvasinky přežívají hladovění. Výzkum, který začal „u droždí“, postupně přerostl v obor, který zasáhl nejen fanoušky jednobuněčných organismů pozorovatelných mikroskopem (a potřebných k výrobě piva), ale který změnil pohled na nás samé. To, co začal Ohsumi s kvasinkami, postupně přerostlo v mechanismus významný pro pochopení mnoha lidských strastí, od Parkinsonovy choroby přes astma, Crohnovu chorobu a rakovinu až po budoucnost nás všech – stárnutí.
Věřím, že v buňkách najdeme některé základní funkce, které se evolučně zachovaly od kvasinek až po savce. To je můj názor. Samozřejmě, vakuola není lysosom, ale myslím, že ty uplně nejzákladnější mechanismy musí být zachovány. To byl můj předpoklad, když jsem začal svou práci.
Sebe-oběd(ť)
Pod pojmem autofagie nejčastěji rozumíme tzv. makroautofagii, situaci, kdy buňka nevybíravě stráví část sebe sama. Tedy svou cytoplazmu, hmotu, která celou buňku vyplňuje, i s jejími organelami. Typickým podnětem, který pomohl i k objevení této skryté schopnosti eukaryotních buněk (ke kterým patří kvasinky stejně jako buňky zvířat, hub nebo rostlin), není nic jiného než hladovění. Na rozdíl od nás buňky v krizové situaci nevyluxují lednici, ale samy sebe.
Rozklad vlastní hmoty buňkám pomáhá získat stavební kameny pro vytváření molekul, bez kterých se neobejdou. Zprvu se zdálo, že buňky jsou v podobě konkrétního autofagického „denního menu“ poměrně nevybíravé a stráví cokoliv, co se v nich samých zrovna namane (jaká to podobnost s lednicí, že?). Další výzkum však odhalil, že buňky umí svůj apetit přizpůsobovat i konkrétní situaci – někdy upřednostní poškozenou organelu, která už není schopna vykonávat svou funkci, jindy se na talíři objeví parazitická bakterie, která do buňky pronikla s úmyslem páchat neplechu pro vlastní užitek. A jak takový buněčný „sebe-oběd“ vypadá?
Celé menu se dá rozdělit na 3 chody: iniciace, tedy zahájení celé reakce a vytvoření tzv. fagoforu (jinak také izolační membrány), nukleace, během které je obsah ke strávení spolknut fagoforem, a elongace, prodloužení a spojení membrány do ohraničené částice – autofagosomu. Autofagosom poté podle typu buňky splyne buďto s vakuolou, anebo s lysosomem.
Autofagické menu pro naše buňky připravují tři klíčové proteinové komplexy s krkolomnými názvy ULK1, PI3KC3 (který obsahuje i protein Beclin 1, ale k tomu se dostaneme později) a ATG16L1. Za normálních okolností všechny tyto komplexy vyčkávají připravené v zákulisí na svou příležitost a jejich vstupu do hry brání jiný komplex s téměř božským názvem mTOR.
V případě, že buňka začne hladovět, je moc mTORu oslabena a proteinové komplexy se vrhnou do akce. Spustí celou kaskádu reakcí, kterých se účastní všechny možné autofagické proteiny a která postupně vytvoří tzv. izolační membránu (iniciace). Ta se začne prodlužovat a objímat kus cytoplazmy včetně přítomných organel (nukleace). Postupně dojde k ohraničení kousku buněčného prostoru (elongace) a celé takto vzniklé tělísko splyne s vakuolou (v kvasinkách) nebo, u zvířat, která ve svých buňkách nemají vakuoly, s lysozomy neboli malými organelkami s trávicími enzymy. Mňam.
Tajná zbraň proti vnitřnímu nepříteli
Jak jsme naznačili výše, autofagický aparát nepřispěchá buňce na pomoc jen v případě nutriční úzkosti, ale i v případě, kdy se do buňky vkrade nějaký ten intracelulární parazit. Do nitra buněk s oblibou před imunitním systémem utíkají mnohé bakterie nebo viry, které využívají enzymy buňky k vlastnímu namnožení. A autofagie je způsob, jak se takových nechtěných návštěvníků elegantně zbavit a ještě na tom případně vydělat nějaké ty živiny. Makrofágy, „profesionální požírači“ imunitního systému, si pomocí mírně modifikované verze autofagie umí poradit např. s Toxoplasmou gondii. Přesně tou toxoplasmou, kterou na vás přenese váš chlupatý kočičí mazlíček a která je podezřelá z toho, že může ovlivňovat i lidské chování. Autofagické zlikvidování vnitřního nepřítele dokonce získalo už i svůj vlastní název – xenofagie.
Bohužel ale tato mocná buněčná tajná zbraň přestala být v průběhu evoluce tak docela tajná a někteří mikrobiální neřádi se naučili, jak se jí vyhnout. Takovou potvůrkou je například Legionella pneumophilia, bakterie, která může způsobovat nepěkné plicní infekce a kvůli které se studenti na Harcově teď nějakou dobu neosprchují, protože se namnožila v jejich rozvodech teplé vody. A některé mršky šly dokonce ještě dál. Třeba enteroviry si s pomocí autofagického aparátu umí vyrobit slušivý membránový kabátek, který jim usnadňuje šíření z buňky na buňku. A pak se takového nechtěného nájemníka zbavte.
Každá mince má dvě strany a v biologii někdy i více. A tak se podle některých výzkumů zdá, že snížená funkce autofagických proteinů naopak chrání před střevní infekcí Citrobacter redentium a zlepšuje přežití pacientů, kteří prodělali plicní infekci způsobenou virem chřipky. V těchto případech totiž autofagie zřejmě pomáhá řádně splašit imunitní reakci. Na druhou stranu – imunitní reakce by se mohla se svou puntičkářskou snahou pozabíjet co nejvíce patogenů přehoupnout v chronickou zánětlivou reakci, který již ubližuje i buňkám tělu vlastním. Pomocí autofagie jsou odstraněny nadbytečné imunitní molekuly a celé tělo se tak může zase „hodit do klidu“. Kromě toho hraje autofagie pravděpodobně roli i v mnoha dalších neinfekčních imunitních procesech, např. ve smrtelné reakci štěpu proti hostiteli po transplantacích kostní dřeně.
Víme jistě, že vlastně nevíme – autofagie u nádorů
Autofagie jednoznačně souvisí s nádorovým bujením. Bohužel si však pořád nejsme jistí, zda je to důvod k radosti nebo pláči. Mnoho výzkumů prokazuje propojení mezi signálními drahami, které se uplatňují v nádorech, a regulací autofagie. Problém je ovšem v tom, že zatímco některé výzkumy naznačují, že autofagie tělo před nádory brání, jiné ji označují za způsob, který nádorovým buňkám pomáhá přežít některé krizové situace, které by je bez autofagie zabily.
Podívejme se například na už zmíněný Beclin-1. Beclin-1 je protein, který v reakci na stres (který je do buněk „přenášen“ pomocí proteinů s hrozivými názvy jako Bad nebo Puma) spouští v buňkách dráhy, které mohou vést k autofagii anebo apoptóze, tedy buněčné smrti. Myšky, které mají genetickou poruchu v genu pro Beclin-1, mnohem častěji trpí nádory. Z tohoto pohledu by se zdálo, že správně fungující autofagie je pro obranu proti nádorům potřebná. Jenže je tu pořád pohled druhý…
Už dlouho víme, že stres (třeba z nedostatku nutrientů), radioterapie (ozařování nádorů) nebo některé cytotoxické léky mohou poškozovat genetickou informaci buněk a vyvolat tak vznik nádoru. Dnes už ale také víme, že všechny uvedené stresory taktéž spouští autofagii, která umožňuje buňkám tenhle šok přežít. A to nejen buňkám zdravým, ale i nádorově změněným, proti kterým se ozařování a cytotoxické terapie snažíme použít. Autofagie nádorovým buňkám umožňuje na chvilinku se uklidnit, přečkat nepřátelské období a později, když jim s tou terapií už dáme trochu pokoj, znovu agresivně vyrůst.
Zdá se tedy, že zatímco v prvních fázích můžeme být za autofagii rádi, protože nás před nádory chrání, v pozdějších fázích nádorového onemocnění už je její ochranitelská povaha spíš na škodu. Tak jako tak je ale její role evidentně důležitá, a proto se vědci po celém světě snaží rozkódovat molekulární detaily, které rozhodují o tom, kdy jsme za autofagii rádi a od kdy nám začíná ubližovat. Přesně takové „malé, ale šikovné” detaily, konkrétní molekuly, které můžeme farmakologicky ovlivňovat, by se totiž mohly uplatnit ve vývoji nové účinné terapie. A to, jak už dnes i díky práci Yoshinori Ohsumiho víme, zdaleka nejen v onkologii.
Čas nelze zastavit. Možná.
Stárnutí fascinuje lidstvo stejně jako vznik života. Všichni víme, že čas nelze zastavit, ale biologická podstata celého procesu, tedy to, co konkrétně je ten nezastavitelný proces, který odsuzuje naše orgány k postupnému selhávání funkce až ke smrti, zůstávalo neprostudováno. Teorií bylo mnoho – od zkracování koncových částí našich chromozomů, čímž se omezuje možnost obnovy našich buněk, přes hromadění „spících” (senescentních) buněk, které postupně omezují funkci našeho těla, až po vliv volných radikálů. Za čas, kterým se věda stárnutím zabývá, vzniklo mnoho více či méně nadějných teorií, některé odešly do věčných vědeckých lovišť, jiné přetrvaly. A v posledních letech se k této plejádě změn asociovaných se stářím přidala i autofagie.
Nejprve si vědci všimli, že ve stárnoucích buňkách dochází k hromadění starých, často funkčně narušených organel (zejména mitochondrií) a dalších neodstraněných metabolitů, kterých se svěží mladé buňky zvládají zbavovat levou zadní. Chybělo však mechanistické vysvětlení takového děje – objev systému, který je v mladých buňkách za buněčný úklid zodpovědný. A takovým mechanismem se stala právě autofagie, která, jak se také ukázalo, je ve starších buňkách funkčně narušena. A vlastně mnohem více.
Nejspíš si vzpomenete na výzkumy na myších, hlísticích a dalších organismech, jejichž výsledkem je zjištění, že restrikce kalorií (čti „nedostávaly tolik najíst”) prodlužuje délku života. Nikdo ale nechápal proč: vždyť když buňkám energie chybí, měly by být stresované a stres by jim, a tedy ani celému organismu, prospívat neměl. Objev autofagie však do záhady vnáší nové světlo. Nedostatek živin v buňkách stimuluje autofagii. Autofagie začne trávit cytoplazmu, organely (snad především ty porouchané?)… a takhle se buňky možná udržují fit. Možná.
Nadějné vyhlídky na šťastnější zítřky
Bezpochyby je autofagie významný buněčný děj. V některých kontextech sice její roli nerozumíme detailně, ale i tak máme dost důkazů o tom, že má smysl se jí zabývat. A souběžně s rozkódováním složitého komplexu vzájemných interakcí různých signálních drah uvnitř buněk se rozběhl i výzkum, který hledá substance se schopností cíleně ovlivňovat konkrétní molekuly nebo dráhy. S jejich pomocí by bylo možné stimulovat nebo naopak tlumit autofagii v léčbě stavů, v nichž autofagie nefunguje tak, jak by měla. Tento výzkum už nejenže identifikoval nové, nadějné substance, které v preklinických testech (na tkáňových kulturách a zvířecích modelech) vypadají více než nadějně, ale dokonce zjistil, že některé takové léky medicína dávno používá, nevědoma si toho, že za část jejich účinku možná vděčíme autofagii. Autofagický aparát tlumí třeba antimalarikum chlorochin, opačně naopak působí Rapamycin, imunosupresivum využívané v transplantační medicíně.
Infekce, nádory, Alzheimer, Parkinson, imunitní problémy, srdeční selhání… Je tolik zdravotních strastí, které našly svého společného jmenovatele – autofagii. Prapodivné kulovité útvary ve vakuole se ukázaly být odpovědí na mnohé otázky a co začalo u kvasinek pod světelným mikroskopem, skončilo u rozvoje nového odvětví farmakologického výzkumu. Je samozřejmě otázkou, u kolika chorob se snaha ovlivnit autofagii setká s úspěchem a u kolika z nich se stejná snaha ukáže jen jako nepříliš významný průvodní jev. Dlouhé jsou cesty medicíny, často trnité a plné klikatých odboček. Moderní medicína ruku v ruce se základním výzkumem po nich však vytrvale kráčí – a za jednu správnou odbočku na velké křižovatce vděčíme profesoru Yoshinori Ohsumimu.
Ano, bylo to štěstí. Kvasinky byly velmi dobrý objekt výzkumu a autofagie byla dobré téma. Ale stále je tu tolik otázek. Vlastně - dnes máme ještě více otázek, než když jsem začínal.
